اهمیت pH در کروماتوگرافی مایع

اهمیت pH در کروماتوگرافی مایع

اهمیت تنظیم pH فاز متحرک:

امروزه کروماتوگرافی مایع پشتوانه بسیاری از جداسازی ها در آزمایشگاههای تحقیقاتی و صنایع دارویی است. اما به همان اندازه که این تکنیک از کارایی بالایی برای این امر برخوردار است، نحوه بکارگیری آن شامل انتخاب صحیح فاز ساکن و متحرک،  بررسی آنالیت مورد نظر از جهت سازگاری آن با HPLC، و رفع مشکلات عمومی آن از اهمیت ویژه ای برخوردار است. لذا هدف از این مقاله مروری بر مفاهیم بنیادی و مهم این تکنیک و رفع برخی مشکلات پیش آمده در حین کار میباشد.

نقش pH در بازداری ترکیبات:

در کروماتوگرافی فاز معکوس (RP)، بازداری ترکیبات بر اساس طبیعت آبگریز و غیرقطبی آنالیت هاست. به این معنا که ترکیبات قطبی تر تمایل کمتری به فاز ساکن غیرقطبی دارند و زودتر از ستون شسته شده و در نتیجه زمان بازداری کمتری دارند. بنابراین ترتیب شویش در کروماتوگرام به ترتیب از ترکیبات قطبی به غیر قطبی میباشد.

در یک جداسازی اگر  تمام ترکیبات خنثی باشند، pH فاز متحرک نقش موثری در جداسازی ایجاد نمی کند و می توان از بهینه سازی آن صرف نظر کرد. این شرایط در کرواتوگرام شکل ۱ نشان داده شده است. در این شکل پیک های ستاره دار مربوط به ترکیبات خنثی بوده و همانطور که مشاهده می شود با تغییر pH از مقدار ۳ به ۷ تغییری در بازداری آنها ایجاد نمی گردد. اما هنگامیکه یک ترکیب یونیزه شونده (اسید یا باز) در مخلوط وجود داشته باشد،‌ تغییر pH تفاوت معناداری در بازداری ایجاد میکند. در شکل ۱ کربوکسیلیک اسیدها به شدت در pH=7 یونیزه می شوند و بار منفی ایجاد شده در این ترکیبات آنها را نسبت به pH=3 قطبی تر کرده و منجر به جابجایی معناداری در بازداری آنها می شود.

 

 

شکل ۱: کروماتوگرام بدست آمده از جداسازی ۶ ترکیب خنثی و ۲ کربوکسیلیک اسید در pH=3,7

بازداری اسیدها و بازها عکس یکدیگر است. این مسئله از منحنی بازداری pH (شکل ۲) مشخص است. طبق شکل ۲-a اسیدها در pH پایین بازداری خوب و در pH‌ بالا یازداری ضعیفی دارند به این دلیل که در pH پایین اسید حالت خنثی داشته در حالی که در pH بالا یونیزه میشود. این قضیه برای بازها بالعکس است (شکل ۲-b). نقطه میانی منحنی های شکل ۲، نقطه PKa است که در آن نیمی از مولکولهای گونه به صورت یونیزه و نیم دیگر آن غیر یونیزه وجود دارند. لازم به ذکر است که در نقطه PKa اگر چه هر دو حالت مولکول وجود دارد اما به دلیل تعادل سریع بین این دو فرم تنها یک ۱یک واحد مشاهده میشود. برای اسیدها وقتی pH در مقادیر پایین تر از PKa تنظیم شود نسبت جز غیر یونیزه به جز یونیزه افزایش یافته و در نتیجه قطبش کلی اسید کاهش می یابد و زمان بازداری بیشتر میشود. همین فرآیند برای بازها در pHهای بالا صادق است. با توجه به شکل ۲ تغییرات یونیزاسیون در دامنه pH=PKa±۱ معنادار بوده و در ابتدا و انتهای منحنی (pH=PKa ±۲) بدلیل اینکه اسید یا باز به طور کامل یونیزه شده یا فرآیند یونیزاسیون متوقف می شود، تغییر pH تغییری در یونیزاسیون نمونه ایجاد نمی کند. بنابراین اثر تغییر PH فاز متحرک بستگی به مقدار آن نسبت به PKa دارد. این بدین معنی است که اگر می خواهیم از pH به عنوان یک فاکتور برای تنظیم بازداری استفاده کنیم، تغییرات در حدود ۵/۱-۱واحد کمتر یا بیشتر از PKa موثر خواهد بود.

 

 

شکل ۲: منحنی بازداری-pH برای a: ترکیبات اسیدی b: ترکیبات بازی

نقش pH در گزینش پذیری:

همانطور که گفته شد اهمیت واقعی بررسی pH فاز متحرک در هنگام توسعه یک روش برای مخلوط اسیدها و بازها در تفاوت ایجاد شده در بازداری ترکیبات با تغییر pH است، بخصوص در مواردیکه مقدار PKa ترکیبات متفاوت باشد. شکل ۳ جداسازی مخلوط ۴ آنیلین که در جدول ۱ گزارش شده است را نشان میدهد. با توجه به جدول، PKa‌ترکیبات بین ۹۸/۳-۶۶/۲ است و طبق موارد گفته شده تغییر pH در ۵/۱ واحد کمتر و بیشتر از PKa موثر خواهد بود و بنابراین دامنه تغییرات بین ۱/۱ (۵/۱-۶۶/۲) و ۵/۵ (۵/۱+۹۸/۳) تعریف می شود. اما از آنجاییکه کار در pH کمتر از ۲ باعث آسیب به ستون می شود ابتدای بازه ۲ در نظر گرفته می شود. با توجه به شکل ۳ تغییرات pH در بازه تعریف شده تفاوت چشمگیری در گزینش پذیری جداسازی ایجاد می کند.

 

 

لازم به ذکر است در مواردیکه pH به عنوان یک فاکتور تاثیرگذار بررسی می شود انتخاب یک pH که استحکام روش را تضمین کند ضروری است. شکل ۴ کروماتوگرام بدست آمده از جداسازی برخی اسیدها را نشان میدهد که pH=5.1 تمامی اسیدها به خوبی جدا شده اند (شکل ۴-a) در حالیکه در pH=5.2 رو پیک آخر در هم ادغام شده اند. بنابراین با توجه به احتمال خطا در تنظیم pH انتخاب این pH مطمئن نخواهد بود.

 

 

 

در انتخاب pH مطمئن و مناسب توجه به فاکتور بازداری (K) ضروری است که مقدار آن در بازه ۱۰-۲  یا طبق برخی مراجع ۲۰-۱ مطلوب است. در شکل ۳-a در pH 2 اگرچه جداسازی صورت گرفته ولی مقدار K برای دو پیک اول کمتر از یک است بنابراین احتمال تداخل پیکها وجود نخواهد داشت.

در pH=2.5 (شکل ۳-b) مقدار K برابر با یک بدست آمده ضمن اینکه جداسازی هم بخوبی صورت گرفته. در pH=2.75 (در شکل گزارش نشده) جداسازی مشابه pH=2.5 انجام می شود. ولی در pHهای بالاار مجدداً تداخل پیک ها مشاهده می گردد. بنابراین انتخاب pH در بازه ۷۵/۲-۵/۲ قابل اطمینان خواهد بود. در انتها لازم به ذکر است جهت تنظیم pH فاز متحرک حتماً از بافر مناسب (استات، فسفات و …) استفاده شود.