ویروزوم‌ها (Virosomes): سیستم‌های حامل آنتی ژن و DNA :
ویروزوم ها وزیکول های فسفولیپیدی (تک لایه یا دو لایه) هستند که پروتئین های اتصالی ویروسی در ساختار آنها بکار رفته است. ویروزوم ها به عنوان سیستم های تحویل دارو یا واکسن به سلول ها عمل می کنند و باعث ایجاد پاسخ ایمنی مطلوب می شوند. پروتئین های پوشش ویروسی بکار رفته در ساختار ویروزم ها به آنها این اجازه را می دهد تا با سلول هدف به راحتی ادغام گردند. در این مقاله مروری خواهیم داشت بر ترکیب و محتوای ویروزوم ها، نحوه ی فرمولاسیون و مکانیسم نفوذ ویروزوم به سلول های هدف و در نهایت روش های مختلفی که برای آنالیز وشناسایی ویروزوم ها به کار گرفته می شود.
۱٫ مقدمه
ویروزوم ها وزیکول های فسفولیپیدی تک لایه کروی با میانگین قطر حدود ۱۵۰ نانو متر هستند که لایه لیپیدی آن ها با پروتئین های ادغامی ویروسی ترکیب شده است. ویروس ها عواملی هستند که واجد اسید نوکلئیک هستند و دارای پوشش پروتئینی (کپسید) در اطراف اسید نوکلئیک هستند اما چون فاقد آنزیم های لازم برای متابولیسم هستند یا معدودی از آنها را دارا می باشند، لذا برای تکثیر یافتن بایستی از ماشین سنتزی سلول میزبان استفاده نمایند. برای آنکه یک ویروس بتواند تکثیر پیدا کند و از خود علائم حیاتی بروز دهد باید ابتدا به داخل سلول میزبان نفوذ کند و در داخل فضای سیتوپلاسمی سلول میزبان به کمک امکانات آن سلول اقدام به تکثیر کنند. برای این منظور باید گیرنده های (Receptor) اختصاصی خود را بر روی غشای سلولی هدف شناسایی کنند و سپس به این گیرنده ها وصل شوند. ویروس با مکانیسم‌های مختلفی ازجمله اندوسیتوز (فرایندی فعال که در آن سلول، مولکول ها یا اجسامی را به داخل خود می‌برد) از دیواره غشای سلول به داخل سلول میزبان کشیده می‌شود. بعد از اینکه ویروس وارد سلول میزبان شد (سلولی که رسپتور یا گیرنده ویروس را دار است) سلول را آلوده می‌کند. طی مراحل منظمی که به نام رپلیکاسیون ویروسی نامیده می‌شود و همچنین به کمک سیستم پروتئین سازی سلول ، ویروس قطعات مختلف خود را در داخل سلول می‌سازد و این قطعات باهم ادغام می‌شوند و ذرات جدید ویروسی تشکیل می‌شوند. ویروزوم ها برخلاف ویروس ها بدلیل فقدان مواد ژنتیکی لازم برای همانندسازی قادر به همانند سازی خود نیستند، ولی بدلیل دارا بودن پروتئین های اتصالی ویروس می توانند به صورت فعال با گیرنده های موجود در غشای سول هدف ادغام شده و وارد سیتوپلاسم سلول گردند. بر خلاف لیپوزوم ها، ویروزوم ها دارای گلیکوپروتئین های پوشش(envelope) ویروسی مثل هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) در غشای خود هستند که آنها را قادر می سازد به راحتی با غشاء دو لایه ای فسفولیپیدی سلول هدف برهمکنش کنند و بتوانند به سلول وارد شوند. خواص منحصر به فرد ویروزوم ها مربوط به وجود گلیکو پروتئین HAدر غشای ویروزوم است که باعث ثبات ساختاری ویروزوم و همچنین وجود خواص ایمونولوژیک آن می شود و به همین دلیل از سیستم های حامل لیپوزومی و پروتئولیپوزومی متمایز است. هماگلوتینین در ویروس ها از طریق برهمکنش با اسید سیالیک گلیکوپروتئین های سطحی غشاء، عمل اندوسیتوز ویروس به سلول را انجام می دهد. بعد از اتصال گیرنده سطحی سلول به هماگلوتینین ویروسی، اندوزوم تشکیل می شود که شامل گیرنده و ویروس می باشد. به خاطر pH اسیدی داخل اندوزوم هماگلوتینین دچار تغییر شکل فضایی در ساختمان خود شده و با غشا اندوزوم ادغام می شود و در نتیجه غشا اندوزوم از هم پاشیده و محتویات ویروس را بداخل سیتوپلاسم رها می کند. در اصل هماگلوتینین در ویروزوم ها همین نقش را بر عهده دارد و باعث می شود ویروزوم بداخل سیتوپلاسم سلول رها شود. واکسن های سنتی به طور کلی متشکل از میکروارگانیسم های غیر فعال یا ضعیف شده هستند که خواص بیماری زایی خود را از دست داده اند، و یا متشکل از زیر واحد های سازنده مانند پروتئین پوشش بیرونی ارگانیسم هستند. این واکسن های پروفیلاکتیک (پیشگیری کننده) باعث ایجاد پاسخ ایمنی هومورال و تحریک سیستم ایمنی بدن می شوند، اما آنها اغلب با عوارض ایمنی نامطلوب همراه هستند. از این رو مهم است که آنتی ژن ها به گونه ای به سیستم ایمنی بدن عرضه شوند که باعث القای یک پاسخ ایمنی خاص و قوی در برابر عوامل پاتوژن گردد. پیشرفت های زیادی در ساخت واکسن ها صورت گرفته و نکته کلیدی در توسعه واکسن های نسل دوم رساندن آنتی ژن ها به سلول های عرضه کننده آنتی ژن (APC،Antigen Presenting Cell) است. ویروزوم ها برای رساندن آنتی ژن به سلول های عرضه کننده آنتی ژن (APC) که القا کننده پاسخ های ایمنی سلولی هستند، استفاده می شوند. در اصل ویروزوم ها پتانسیل بالایی در ایجاد واکنش های سیستم ایمنی دارا هستند علاوه بر اینکه عوارض جانبی را هم کاهش می دهند [۱و۲].
۲٫ تاریخچه
واژه ی ویروزوم برای اولین بار در سال ۱۹۷۵ توسط آلمیدا و همکارانش ابداع شد. آلمیدا متوجه یافته های غیر منتظره ای از یک ساختار شبه ویروسی در طول مشاهده ذرات لیپوزومی متشکل از چربی، هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) شد. این ساختار ویروزوم آنفولانزا نام گرفت، زیرا اجزای کلیدی گلیکوپروتئینی آن یعنی HA و NA از ویروس آنفولانزا مشتق شده است. این اولین گزارش از وزیکول هایی بود که ساختار خود را از پاکت ویروسی تقلید می کردند [۲]. شکل(۱) نشان دهنده تفاوت ساختاری ویروزوم با ویروس آنفولانزا است.
شکل۱٫ نمایی شماتیک از تفاوت ساختاری ویروس آنفولانزا و یک ویروزوم [۱]
۳٫ ویژگی های ویروزوم ها و مزایای آن ها
تکنولوژی ویروزوم یک سیستم تحویل گسترده ای را برای آنتی ژن و DNA / RNA فراهم می کند که به ترتیب باعث تحریک سیستم ایمنی بدن وکد گذاری و بیان پروتئین های خاص می شوند. ویروزوم ها قادر به تحویل آنتی ژن به سلول هدف خاصی هستند که پاسخ سیستم ایمنی را تقویت کنند. همچنین ویروزوم ها قادر هستند هر دو پاسخ سیستم ایمنی بدن ( پاسخ ایمنی هومورال با ترشح آنتی بادی ها و پاسخ ایمنی سلولی با فعال کردن سلول های T) در برابر پاتوژن ها را تحریک کنند. از مزایای ویروزوم می توان به این موارد اشاره کرد:
• ثبات ساختمانی پروتئین ها و پپتید های آنتی ژن و محافظت آنتی ژن از تخریب خارج سلولی
• ارائه آنتی ژن به سلول های B در آرایه های تکراری بر روی سطح ویروزوم
• تحریک قوی سیستم ایمنی از طریق بکارگیری سلول های T helper
• زیست تخریب پذیری
• ایمنی (safety) بالا و مناسب برای جمعیت های آسیب پذیر مثل سالمندان و نوزادان و کسانی که سیستم ایمنی آنها سرکوب شده است [۱].
۴٫ فرمولاسیون ویروزوم ها
روش های آماده سازی ویروزوم بسیار گسترده است اما همه ی این روش ها از یک اصل اساسی پیروی می کنند. شکل (۲) نمایی شماتیک از نحوه فرمولاسیون ویروزوم را نشان می دهد. در ابتدا باید مقدار زیادی از ویروس های مربوطه در مقیاس میلی گرم تولید و خالص سازی گردد. پس از آن پوشش ویروس در مواد شوینده (detergent) مناسب حل شده و از اجزای غیر قابل حل (نوکلئوکپسید حاوی ماده ژنتیکی) جدا می شود. در نهایت، مواد شوینده حذف می شود[۳]. رایج ترین فسفولیپیدهای مورد استفاده در فرمولاسیون ویروزوم ها دی اولئیل دی متیل آمونیوم کلراید (DODAC) و دی اولئیل اکسی پروپیل تری متیل آمونیوم متیل سولفات (DOTAP) است [۲]. یک نمونه از فرمولاسیون ویروزوم ها که کاربرد زیادی در علم پزشکی دارد، ویروزوم آنفولانزای تقویت کننده سیستم ایمنی (Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes, IRIVs ) است. فرمولاسیون IRIVs بدین صورت است که با استفاده از مواد شوینده مناسب گلیگوپروتئین های هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) پوشش ویروس آنفولانزا از اجزای غیر قابل حل خود جداسازی می گردد. پس از جداسازی، این گلیکوپروتئین ها با فسفولیپید های طبیعی و سنتزی ترکیب می شوند و ویروزوم IRIVs حاصل می شود. فسفولیپیدهای تشکیل دهنده ویروزوم از ۷۰% لسیتین که یک جزء ساختاری است، ۲۰% سفالین که باعث تحریک سلول هایB می شود و آنتی ژن می تواند به این قسمت متصل شود و ۱۰% از پوشش فسفو لیپیدی ویروس آنفلوانزا انتخاب می شوند [۱] . برای آماده سازی ویروزوم ها مشکلاتی ممکن است وجود داشته باشد که عبارتند از:
• ماندگاری یا عمر مفید خیلی کوتاه ویروزوم ها
• مشکلات مربوط به اندازه بالای ویروزوم ها در هنگام آماده سازی که قادر به عبور از غشا سلولی نمی باشند
• عدم وجود هر گونه اطلاعات در مورد ایمنی این سیستم حامل در مصرف طولانی مدت
اما در سال های اخیر چندین راه حل برای حذف مشکلات ذکر شده در بالا ایجاد شده است:
• عمر مفید یا ماندگاری ویروزوم را در حین خشک کردن با روش خشک کن انجمادی (Freez drying) می توان با استفاده از کرایوپروتکتانت (cryoprotectant) و لیوپروتکتانت (lyoprotectant) مناسب افزایش داد.
• اندازه مناسب را می توان با انتخاب روش آماده سازی دقیق، استریلیزاسیون با اتوکلاو و فیلتراسیون غشایی (۰/۲ میکرومتر) بهبود بخشید.
• در نهایت با انتخاب داروی مناسب با پنجره درمانی باریک مشکلات ایمنی مربوط به دارو را می توان کاهش داد.
۴-۱-آماده سازی ویروزوم برای آنتی ژن رسانی
اخیرا از ویروزوم به عنوان سیستم تحویل پپتید و اسید نوکلئیک استفاده شده است. ویروزوم ها به عنوان حامل آنتی ژن از پپتید و ادجوانت ( ترکیبات شیمیایی یا بیولوژیکی هستند که باعث تحریک غیر اختصاصی سیستم ایمنی، علیه آنتی ژن یا آنتی ژن هایی می شوند که به همراه آن تزریق شده است) محافظت می کنند و باعث ایمنی مضاعف در بدن می شوند. ویروزوم ها باعث رساندن آنتی ژن به سیتوپلاسم سلول های APC می شوند. شکل (۳) نمایی شماتیک از ورود ویروزوم به داخل سلول و مکانیسم ساخت کمپلکس اصلی سازگاری بافتی (MHC, Major Histocompatibility Complex) را نشان می دهد. MHC به مجموعه ای از پروتئین ها گفته می شود که آنتی ژن میکروب های درون سلولی را به سلول های T عرضه می کنند. مکانیسمی که طی آن APC باعث ساخته شدن کلاس Iمی شود، شامل چند مرحله است: ویروزوم به گیرنده های موجود در غشاء APC از طریق هماگلوتینین متصل می شوند، سپس از طریق اندوسیتوز به واسطه ی گیرنده ویروزوم اندوسیتوز می شود و تحت تاثیر PH داخل اندوزوم هماگلوتینین دچار تغییر کانفورماسیون شده و با غشاء اندوزوم ادغام شده و محتویات ویروزوم بداخل سیتوپلاسم آزاد می شود، پروتئین های آزاد شده ویروزوم تحت تاثیر آنزیم های سیتوپلاسمی قرار می گیرند و نهایتا پس از آن که تحت تاثیر آنزیم ها قرار گرفت روی مولکول های MHC کلاس Iسوار می شوند و در نتیجه MHC ارائه کننده آنتی ژن روی غشا سلول ظاهر می شود. مکانیسم ساخت MHC کلاس IIیک تفاوت عمده دارد و آن این است که مراحل آنزیم از طریق لیزوزوم صورت می گیرد. بدین صورت که اندوزوم حاوی ویروس به سمت لیزوزوم رفته و با لیزوم ادغام شده ومحتویات خود را بداخل لیزوزوم آزاد می کند. سپس هماگلوتینین ویروسی با لیزوزوم ادغام شده و باعث در هم پاشیدن غشاء لیزوزوم و آزاد شدن محتویات آن به سیتوزول می شود، که نهایتا پروتئین های ویروسی روی MHC کلاس II سوار شده و این مولکول ها روی غشاء سلول ظاهر می شوند و باعث القای پاسخ سیستم ایمنی می شوند [۱]. شکل (۴) فعال شدن سلول های T سیتوتوکسیک توسط آنتی ژن ویروزوم را نشان می دهد. ویروزوم باعث افزایش بیان B7-1، B7-2 و CD40 (مولکول های محرک سطح سلول) و در نتیجه باعث افزایش تعامل موثر میان سلول های T و APC ها می شود. سلول های T helper دارای مارکر سطحی+ CD4 هستند و پپتیدهای ویروسی متصل به MHC کلاس II را تشخیص می دهند، و باعث بیان سیتوکین های سلول های T helper نو ع ۱ ( اینترفرون γ [ IFN- γ] ، فاکتور تومورال نکروز آلفا [TNF-a] و فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت ماکروفاژ [GM-CSF]) می شود. سلول های کشنده (T cytotoxic) دارای مارکر CD8+ هستند، که پپتیدهای ویروسی متصل به MHC کلاس I را تشخیص می دهند. سیتوکین های T helper نو ع ۱ باعث ایجاد سیگنال فیدبکی تحریکی به APC برای ارائهMHC کلاس I به سطح سلول می شوند. شکل (۴) نمایی شماتیک از تحریک سیستم ایمنی توسط ویروزوم را نشان می دهد [۵].
شکل ۳٫ نمایی شماتیک از ورود ویروزوم به داخل سلول و مکانیسم ساخت [ MHC 5]
شکل۴٫ فعال شدن سلول های T cytotoxic و T helper توسط ویروزوم [۵]
۴-۲- آماده سازی ویروزوم برای دارورسانی
دارورسانی هدفمند با استفاده از سیستم های مبتنی بر ویروزوم می تواند از طریق تغییرات سطحی (اضافه کردن آنتی بادی ها و لیگاندهای اختصاصی سلول هدف) حاصل شود. تعدادی از محصولات پروفیلاکتیک و درمانی ویروزوم با ایمنی بالا در حال حاضر در بازار موجود است. پروتئین ها، پپتیدها و داروهای مختلف داخل ویروزوم انکپسوله شده و با استفاده از تغییرات سطحی مناسب، در سیتوپلاسم سلول هدف آزاد می شوند. یک کاربرد موفق از این سیستم تحویل دارو، توسط Waelti و همکارانش شرح داده شد. مطالعه آنها مهار پیشرفت تومور با استفاده از فرمولاسیون ویروزومی را در مدل حیوانی نشان داد. در فرمولاسیون آنها از فسفولیپید فسفاتیدیل اتانول آمین و پلیمر پلی اتیلن گلیکول برای هدف گیری سلول وگلیکوپروتئین ویروسی هماگلوتینین برای تحویل سیتوپلاسمی داروی دوکسوروبیسن به سیتوپلاسم سلول های سرطانی استفاده گردید. پس از اندسیتوز به واسطه گیرنده وتشکیل اندوزوم، ویروزم قادر به انتقال محتویات خود (دارو) به سیتوزول خواهد بود. با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال که آنتی ژن توموری را شناسایی می کنند، ویروزوم را می توان برای سلول های سرطانی هدفمند کرد و باعث ایمونوتراپی شد.
۵٫ برهمکنش ویروزوم با سلول های سیستم ایمنی
به دلیل آرایش تکراری هماگلوتینین در سطح ویروزوم، ویروزوم ها به طور موثری با گیرنده های ایمونوگلوبولینی روی سلول های لنفوسیتی B برهمکنش می دهد. ویروزوم ها همچنین توسط سلول های دندریتیکی برداشت می شوند، آنتی ژن روی سطح ویروزوم پس از تخریب ویروزوم وارد مسیرMHC کلاس II شده و باعث فعال شدن سلول های T کمکی می شوند. آنتی ژن های ویروزوم همچنین از طریق مسیر MHC کلاس I باعث فعال شدن لنفوسیتT سیتوتوکسیک می شوند. شکل ۵ برهمکنش ویروزوم با سلول های سیستم ایمنی را نشان می دهد. خواص منحصر به فرد ویروزوم مربوط به حضور HA در غشاء ویروزوم است. ویروزوم ها بطور انتخابی بوسیله ی لیگاندشان به سلول هدف وصل می شوند. به همین ترتیب هماگلوتینین ویروزوم ها با اندوسیتوز بواسطه ی گیرنده به سلول هدف وصل می شود، بدلیل اسیدی بودن داخل اندوزوم هماگلوتینین ویروزوم دچار یک تغییر در ساختمان خود شده و با غشای اندوزوم ادغام می شود ومواد درمانی فعال از اندوزوم فرار کرده و بداخل سیتوپلاسم سلول هدف رها می شوند.
شکل ۵٫ برهمکنش ویروزوم با سیستم ایمنی [۱]
۶٫ مطالعات مختلف مربوط به استفاده از ویروزوم ها به عنوان سیستم حامل
مطالعات مختلف با استفاده از فرمولاسیون ویروزمی به عنوان حامل آنتی ژن به سلول های ایمنی کارایی بهتر این واکسن ها را نشان داده است. استفاده از ویروزوم ها به عنوان سیستم حامل آنتی ژن رسانی به سلول ها در جدول زیر به صورت خلاصه آورده شده است. بسیاری از واکسن ها در مرحله مطالعات بالینی هستند.
جدول ۱٫ نمونه ای از واکسن های ویروزومی و کاربرد آن ها[۱]
۷٫ روش های شناسایی ویروزوم
ویروزوم ها به راحتی توسط میکروسکوپ الکترونی قابل شناسایی هستند. برهمکنش ویروزوم با سلول توسط روش انتقال انرژی رزونانس فورستر (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET قابل مشاهده می باشد. شکل(۶) تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری ویروزوم را نشان می دهد.
شکل ۶٫ تصویر میکروسکوپ الکترونی ویروزوم [۶]
نتیجه گیری
ویروزوم ها وزیکول های فسفولیپیدی تک لایه یا دولایه ای هستند، که به عنوان حامل آنتی ژن، DNA و دارو نقش موثری در واکسن ها و سیستم های دارورسانی نوین بازی می کنند. در فرمولاسیون ویروزوم از گلیکوپروتئین های پوشش ویروسی و فسفولیپید استفاده می شود که بعد از آماده سازی ویروزوم آنتی ژن یا دارو داخل ویروزوم انکپسوله می شود. مزایای ویروزوم ها به عنوان حامل آنتی ژن، DNA و دارو عبارت است از: زیست تخریب پذیری، حفاظت از آنتی ژن و پپتیدها در برابر تخریب خارج سلولی، تحریک قوی سیستم ایمنی ایمنی بالا. ویروزوم ها بدلیل تحریک قوی سیستم ایمنی، پیش نیازهای ضروری برای یک ادجوانت و سیستم حامل استاندارد مناسب برای نسل جدید واکسن های پروفیلاکتیک را ارائه کرده اند.
منبع : edu.nano.ir