مقالات

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

چکیده: کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) یک تکنیک مهم برای اندازه گیری­های کمی و کیفی است، که عموما برای برآورد نمونه های بیولوژیکی و دارویی استفاده می شود. این روش تطبیق پذیرترین، بی خطرترین، قابل اعتمادترین و سریع ترین روش کروماتوگرافی برای کنترل کیفیت ترکیبات دارویی است. این مقاله با هدف بررسی ابعاد مختلف HPLC، مانند اصول، انواع، دستگاهوری و کاربرد، تهیه شده است.

مقدمه

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (یا کروماتوگرافی مایع فشار بالا، HPLC) فرم خاصی از کروماتوگرافی ستونی است که به طور کلی در بیوشیمی و آنالیز جداسازی، شناسایی، و بررسی کمی ترکیبات فعال استفاده می شود.[۱]HPLC  به طور عمده تشکیل شده است از یک ستون که دارای مواد پرکننده (فاز ثابت) می باشد، یک پمپ که فاز متحرک را در طول ستون عبور می دهد و آشکارسازی که زمان نگهداری ملکول ها را نشان می دهد. زمان نگهداری بسته به تعاملات بین فاز ثابت، مولکول مورد تجزیه، و حلال(ها) تغییر می کند.[۲] نمونه مورد تجزیه و تحلیل در حجم کوچک به جریان فاز متحرک معرفی می شود و توسط فعل و انفعالات فیزیکی یا شیمیایی با ثابت فاز نگهداری می شود. مقدار زمان نگهداری به طبیعت ماده آنالیت و ترکیب هر دو فاز متحرک و فاز ثابت بستگی دارد. زمانی که در آن آنالیت خاص شسته می شود (از  انتهای ستون بیرون می آید) زمان نگهداری نامیده می شود. حلال های رایجی که استفاده می شود شامل هر ترکیب قابل اختلاط از آب و مایعات آلی (شایع ترین آنها متانول و استونیتریل هستند) می باشد. [۲، ۳] جداسازی با ایجاد تغییر ترکیب فاز متحرک در طول آنالیز قابل انجام است که آن به عنوان شویش گرادیانت (شیب) شناخته می شود. [۳] گرادیانت مخلوط آنالیت را به عنوان یک تابع از میل آنالیت به فاز متحرک جاری جداسازی می کند. انتخاب حلال ها، افزودنی ها(بافر) و درصد شیب حلال ها به ماهیت فاز ساکن و آنالیت بستگی دارد.

انواعHPLC

انواع HPLC به طور کلی به سیستم فاز مورد استفاده در فرایند بستگی دارد. [۳، ۴] انواع  مختلف HPLC که به طور کلی استفاده می شود در آنالیز شامل موارد زیر می شود.

کروماتوگرافی فاز نرمال:

 همچنین بعنوان فاز عادی شناخته شده (NP–HPLC)، این روش آنالیتها را بر اساس قطبیت جدا
می کند. در NP–HPLC از فاز ساکن قطبی و فاز متحرک غیر قطبی استفاده می شود. آنالیت قطبی با فاز ساکن قطبی برهمکنش دارد و نگهداری می­شود. قدرت جذب با افزایش قطبیت آنالیت افزایش می یابد، و برهمکنش بینآنالیت قطبی و فاز ساکن قطبی زمان شستشو را افزایش می دهد.

کروماتوگرافی فاز معکوس:

فاز معکوس HPLC (RP–HPLC و یاRPC) دارای یک فاز ساکن غیر قطبی و یک فاز متحرک آبی نسبتا قطبی می­باشد. RPC بر اساس برهمکنش آبگریزی عمل می کند، که نتیجه نیروهای دافعه بین شوینده قطبی، آنالیتنسبتا غیر قطبی، و فاز ساکن غیر قطبی می باشد. اتصال آنالیت به فاز ساکن متناسب با سطح تماس قسمت های غیر قطبی ملکول های آنالیت در همراهی با لیگاندهای حلال آبی است.

کروماتوگرافی اندازه طردی: کروماتوگرافی اندازه طردی (SEC)، همچنین به عنوان کروماتوگرافی نفوذ ژل و یا کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون به طور عمده ذرات را بر اساس اندازه جدا می­کند. همچنین برای تعیین عالی مفید ساختار سه تایی و چهارتایی پروتئین ها و اسیدهای آمینه است. این تکنیک به طور گسترده برای تعیین وزن مولکولی پلی ساکاریدها استفاده می­شود.

کروماتوگرافی تبادل یونی:

در کروماتوگرافیتبادل یونی، نگهداری بر اساسجاذبه بینیونهایمحلولوقسمت های باردار فاز ساکن می باشد. یونبا بار یکسان استخراج می شوند.این شکل ازکروماتوگرافیبه طور گسترده ایدرتصفیه آب،کروماتوگرافیتبادل لیگاند،کروماتوگرافیتبادل یونیپروتئین ها، کروماتوگرافیتبادل آنیون با PH بالاازکربوهیدرات ها والیگوساکاریدها، و غیره [۳، ۴] استفاده می شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی:

جداسازی بر اساس برهمکنش برگشت پذیر خاص از پروتئین با لیگاندها است. لیگاندها که به صورت کوالانسی به یک نگهدارنده جامد متصل هستند در ماتریکس میل ترکیبی، پروتئین ها را از طریق برهمکنش با لیگاندهای پیوند داده  شده با ستون نگهداری می کنند.

پروتئین ها متصل به ستون bioaffinity می توانند به دو روش از ستون خارج شوند:
• شستشوی Biospecific: وارد کردن لیگاندهای آزاد در بافر شستشو که با لیگاندهای پیوند داده شده با ستون رقابت می کنند.
• شستشو Aspecific: تغییر در pH، نمک، و غیره که برهمکنش پروتئین را با بستر ستون تضعیف می کند.

 به دلیل برهمکنش ویژه بین ، کروماتوگرافی bioaffinity می تواند منجر به تصفیه بسیار بالا شود (۱۰ – ۱۰۰۰ برابر).

پارامترها

برای آنالیز دقیق یک ترکیب، برخی از پارامترها وجود دارد که به عنوان استاندارد برای یک ترکیب خاص استفاده می­شود. یک تغییر در پارامترها ممکن است تا حد زیادی نتایج را تحت تاثیر قرار دهد. متداول ترین پارامترهای مورد استفاده قطر داخلی، اندازه ذرات، اندازه حفره، فشار پمپ هستند. برای ترکیبات مختلف پارامترها با توجه به طبیعت و خواص شیمیایی آنها تغییر می­کند.

قطر داخلی: قطر داخلی (ID) ستون HPLC یک جنبه حیاتی است که مقدار آنالیتی که می­تواند بر روی ستون بارگذاری شود را تعیین    می­کند و همچنین بر روی حساسیت تاثیر می­گذارد. ستون های بزرگتر معمولاً درکاربردهای صنعتی مانند خالص سازی محصول دارویی برای استفاده های بعدی دیده می­شود. ستون با قطر داخلی ID پایین دارای حساسیت بهبود یافته و مصرف حلال کمتر در هزینهظرفیت بارگذاری می باشد.

اندازه ذرات:اکثرHPLCسنتیبافاز ثابتمتصل شده بهذرات کرویکوچکسیلیس(دانه های بسیار کوچک) انجام می شود. ذراتکوچکتر به طور کلیمساحت سطحبیشتری فراهم می کند وجداسازیآن ها بهتر است، امافشارمورد نیاز برایسرعت خطیبهینهبامعکوس مربع قطر ذرات افزایش می یابد.

اندازه منافذ: بسیاری از فازهای ثابت برای ارائه سطح بیشتر متخلخل هستند.

منافذ کوچک مساحت سطح بیشتری دارند در حالی که اندازه منافذ بزرگتر سینتیک بهتری به ویژه برای آنالیتهای بزرگتر دارند. اندازه منافذ توانایی مولکول آنالیت را برای نفوذ به داخل ذرات و برهمکنش با سطح داخلی آن تعریف می کند. این امر به ویژه مهم است زیرا نسبت سطح بیرونی ذرات به درونی آن تقریبا ۱: ۱۰۰۰ است. برهمکنش مولکولی سطح به طور عمده در سطح درونی ذرات رخ می دهد.

فشار پمپ: پمپ ها دارای ظرفیت فشار متفاوت هستند، اما عملکرد آنهادرتوانایی آن برایایجاد سرعت جریانثابت وتکرار پذیر محاسبه می شود. سیستم هایHPLCمدرن برای کار درفشار بسیار بالاتر بهبود یافته اند، و در نتیجهقادر به استفاده ازاندازه ذراتبسیار کوچکتردرستون (<2 میکرومتر) است.

تجهیزات 

تزریق نمونه: انژکتورهای سپتوم در دسترس هستند که با استفاده از آن نمونه تزریق می شود. نمونه می تواند زمانی که فاز متحرک روان و یا متوقف باشد تزریق شود. دریچه دوار و حلقه انژکتور پیشرفته جدید می­تواند برای ایجاد نتایج تکرارپذیر مورد استفاده قرار گیرد.

آشکارساز: راه­های مختلفی برای تشخیص زمانی که یک ماده از داخل ستون عبور می کند وجود دارد.  طیف سنجی UV عمومی متصل است به دستگاه، که ترکیبات خاص را شناسایی می کند. بسیاری از ترکیبات آلی نور UV با طول موج مخلتفی جذب می­کنند. مقدار نور جذبی به مقدار ترکیب خاص بستگی دارد که پرتو در آن زمان از آن عبور می کند.

تفسیر خروجی از آشکارساز: خروجی به عنوان مجموعه ای از قله ها ثبت می شود که هر کدام از پیکها نمایان گر یک ترکیب در مخلوط است که از آشکارساز عبور کرده و  نور UV را جذب کرده است. سطح زیر پیک متناسب بامقدار ماده است که از آشکارساز عبور کرده است، و این منطقه می تواند به طور خودکار توسط کامپیوتر متصل به صفحه نمایش محاسبه گردد.

کاربرد

اطلاعات که که می تواند با استفاده از HPLC به دست آید شامل شناسایی، تعیین مقدار، و جداسازی ترکیبات است. HPLC آماده سازی به روند جداسازی و تصفیه ترکیبات ارجاع دارد که با HPLC تجزیه ای متفاوت است، که در آن تمرکز برای به دست آوردن اطلاعات در مورد ترکیب نمونه است.

جداسازی شیمیایی: بر اساس این واقعیت است که ترکیبات خاص سرعت مهاجرت متفاوتی در یک ستون و فاز متحرک خاص دارند، میزان یا درجه جدایی عمدتا با انتخاب فاز متحرک و ثابت فاز تعیین می شود.

تصفیه: تصفیه به عنوان روند جداسازی و یا استخراج ترکیب هدف از مخلوط ترکیبات یا آلودگی هاست. هر ترکیب یک پیک مشخصه تحت شرایط خاص کروماتوگرافی دارد. مهاجرت ترکیبات و آلودگی ها از طریق ستون نیازمند تفاوت کافی در ساختار آنها است به طوری که ترکیب خالص مورد نظر را بتوان جمع آوری و یا بدون ورود ترکیب ناخواسته دیگر استخراج نمود.

شناسایی: روش کلی شناسایی ترکیبات با استفاده از HPLC انجام شده است. پارامترهای این روش باید به گونه ای باشد که یک پیک تمیز از نمونه شناخته شده در کروماتوگراف مشاهده شود. پیک شناسایی باید زمان ماند منطقیداشته باشد و باید به خوبی از پیک های غیر اصلی در حد تشخیص روشی که انجام می شود جدا باشند.

کاربردهای دیگر HPLC : کاربردهای دیگر HPLC شامل:

کاربردهای دارویی
• مطالعه انحلال قرص به شکل دوزهای دارویی.
• تعیین زمان عمر محصولات دارویی.
• شناسایی مواد تشکیل دهنده فعال اشکال دارویی
• کنترل کیفیت دارویی

کاربردهای محیط زیستی
• تشخیص ترکیبات فنلی در آب آشامیدنی
• شناسایی دیفن هیدرامین نمونه رسوبگذاری شده
• نظارت زیستی بر آلاینده

پزشکی قانونی 

اندازه گیری کمی مواد مخدر در نمونه های بیولوژیکی.
• شناسایی استروئیدهای آنابولیک در سرم، ادرار، عرق، و مو
• تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی از رنگ های نساجی.
• تعیین کوکائین و متابولیت های در خون.

بالینی
• اندازه گیری کمی از یون ها در ادرار انسان

تجزیه و تحلیل آنتی بیوتیک ها در پلاسمای خون.
• تخمین بیلی روبین و بیلی وردین در پلاسمای خون در مورد اختلالات کبد.
• تشخیص نوروپپتید درون زا در مایعات خارج سلولی مغز.

غذا و چاشنی ها
• حصول اطمینان از کیفیت نوشابه و آب آشامیدنی.
• آنالیز آبجو.
• آنالیز شکر در آب میوه.
• آنالیز ترکیبات چند حلقه ای در سبزیجات.
• آنالیز ردیابی مواد منفجره نظامی در محصولات کشاورزی.

نتیجه گیری

از تمام بررسی ها می توان به این نتیجه رسید که HPLC یک تکنیک کروماتوگرافی همه کاره و تکرار پذیر برای تخمین محصولات دارویی است. این روش کاربرد وسیعی در زمینه های مختلف برای اندازه گیری تخمین کیفی و کمی ملکول های فعال دارد.

مراجع :

  1.  Martin M., Guiochon, G. Effects ofhigh pressures in liquidchromatography. J. Chromatogr.A, 2005; (1-2)7: 16-38.
  2. Liu Y., Lee M.L. Ultrahigh pressureliquid chromatography using elevatedtemperature. Journal ofChromatography. 2006; 1104 (1-2): 198–۲۰۲٫
  3.  Abidi,S.L. High-performance liquidchromatography of phosphatidic acidsand related polar lipids. J. Chromatogr. 1991; 587: 193-203.
  4. Hearn M.T.W. Ion-pairchromatography on normal andreversed-phase systems. Adv.  Chromatogr. 1980; 18: 59–۱۰۰.
  5.  Bergh J. J., Breytenbach, J. C.  Stability-indicating High-performanceLiquid- chromatographic Analysis ofTrimethoprim in Pharmaceuticals. J.  Chromatogr. 1987; 387: 528-531.
  6. Stubbs C., Kanfer, I. Stability-indi– cating High-performance Liquid–chromato- graphic Assay of Erythromycin Estolate in Pharmaceutical Dosage Forms. Int. J. Pharm. 1990; 3(2): 113-119.
  7.  MacNeil L., Rice J. J., Muhammad N. Lauback R. G. Stability-indicating Liquid-chromatographic Determination of Cefapirin, Desacetylcefapirin and Cefapirin Lactone in Sodium Cefapirin Bulk and Injectable Formulations. J. Chromatogr. 1986; 361: 285-290.
  8.  Bounine J. P., Tardif B., Beltran P. Mazzo D. J. High-performance Liquid–chromatographic Stability-indicating Determination of Zopiclone in Tablets.J. Chromatogr. 1994; 677(1): 87-93.
  9.  Lauback R. G., Rice J. J., Bleiberg B., Muhammad N., Hanna, S. A. 1984. Specific High-performance Liquid–chromato- graphic Determination of Ampicillin in Bulks, Injectables, Capsules and Oral Suspensions by Reversed-phase Ion-pairChromatography. J. Liq. Chromatogr. 1984; 7(6): 1243-1265.
  10. Wiklund A E., Dag B., Brita S. Toxicity evaluation by using intact sediments and sediment extracts. Marine Pollution Bulletin (2005);  ۵۰(۶): ۶۶۰-۶۶۷٫
  11.  Kwok Y. C., Hsieh D. P. H., Wong P. K. Toxicity identification evaluation (TIE) of pore water of contaminated marine sediments collected from HongKong waters. Marine Pollution Bulletin. 2005; 51(8-12): 1085-1091.
  12.  Hongxia Yu., Jing C., Cui Y., Shang H., Ding Z., Jin H. Application of toxicity identification evaluation procedures on wastewaters and sludge from a municipal sewage treatment works with industrial inputs. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004; 57(3): 426-430.
  13.  Ayerton J. Assay of ceftazidime inbiological fluids using high-pressure liquid chromatography. J. Antimicrob. Chemother. 1981; 8: 227-231.
  14.  Bowden R.E., Madsen P.O. High– pressure liquid chromatographic assay of sulbactam in plasma, urine andtissue. Antimicrob. Agents Chemother.  ۱۹۸۶; ۳۰: ۳۱-۲۳۳٫
  15.  Haginaka J., Yasuda H., Uno T., Nkagawa T. Alkaline degradation and determination by high-performance by high-performance liquid chromatography. Chem. Pharm. Bull. 1984; 32: 2752-2758
  16.  Fredj G., Paillet Aussel M. F., Brouard A., Barreteau H., Divine C., Micaud M. Determination of sulbactam in biological fluids by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1986; 383: 218-222.
  17.  Rodenas V., Garcia M.S., Sanchez–Pedreno C., Albero M.I. Flow–injection spectrophotometric determination of frusemide or sulphathiazole in pharmaceuticals. J. Pharm. Biomed. Anal. 1997; 15: 1687-1693.
  18.  Shah A.J., Adlard M.W., Stride J.D. A sensitive assay for clavulanic acid and sulbactam in biological fluids by high–performance liquid chromatography and precolumn derivatization. J.Pharm. Biomed. Anal. 1990; 5: 437– 443.
  19.  Abidi S.L. High-performance liquid chromatography of phosphatidic acids and related polar lipids. J.Chromatogr. 1991; 587: 193-203.
  20.  Christie W.W., Gill S., Nordbäck J., Itabashi Y., Sanda S., Slabas A.R. New procedures for rapid screening of leaf lipid components from  Arabidopsis. Phytochemical Anal. 1998; 9: 53-57

 

 

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.